Опубликовано в журнале:
«Иммунология» 1994, № 2, с. 47-50

ИММУНОТЕРАПИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ НОВОГО ИММУНОСТИМУЛЯТОРА ГЛИКОПИНА

Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, А.А. Бутаков, Т.М. Андронова, Е.Г. Буланова, В.А. Будагян
Институт иммунологии Минздрава РФ; Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН, Москва
Введение. Как известно, пептидогликаны клеточной стенки бактерий обладают выраженными иммуностимулирующими свойствами. Изучение и применение в клинической практике этих веществ как иммуностимуляторов началось с установления в 1974 г. связи иммуностимулирующего эффекта адъюванта Фрейнда с мурамилпептидами - компонентами клеточной стенки Mycobacteria tuberculosis [7]. Эти данные послужили основанием для получения синтетического аналога минимального компонента клеточной стенки N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглютамина [9], который по иммуностимулирующей активности эквивалентен целым микобактериям в составе полного адъюванта Фрейнда.

Глюкозаминилмурамилпептиды, в частности N-ацетилглюкозаминил-мурамил-L-аланин - D-изоглютамин (ГМДП), были изолированы при анализе противоопухолевого препарата бластолизина, который представляет собой гидролизат клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus [6]. Развивая это направление, Т. Andronova и V. Ivanov [4] разработали оригинальную методику для получения гликопептида клеточной стенки бактерий ГМДП, которая включает конденсацию дипептида с дисахаридом, полученным из М- lysodeikticus.

В многочисленных экспериментах показаны выраженные иммуностимулирующие свойства ГМДП, причем в наибольшей степени стимулирующий эффект распространяется на фагоцитоз и клеточный иммунитет. Установлено, что ГМДП усиливает образование макрофагами фактора некроза опухолей и интерлейкина-1 [2], индуцирует экспрессию Ia-антигенов на клеточной мембране макрофагов [10], усиливает продукцию макрофагами одного из главных факторов бактерицидности - супероксидного радикала и понижает активность 5-нуклеотидазы [5]. После 4-кратного введения ГМДП лимфоциты мышей - опухоленосителей линии С57В1/6 (лимфома EL-4) строго специфично лизировали клетки этой лимфомы при полном отсутствии литического эффекта у мышей - опухоленосителей, не получавших ГМДП [3]. Фармкомитет России разрешил клинические испытания ГМДП, получившего название гликопин.

В связи с данными о выраженной способности гликопина стимулировать функциональную активность фагоцитарных клеток цель данной работы заключалась в клинической и иммунологической оценке эффективности гликопина в лечении и профилактике инфекционных осложнений после оперативного вмешательства на толстой кишке. Операции на толстой кишке часто сопровождаются гнойно-септическими осложнениями, возникающими как следствие снижения иммунной реактивности и прежде всего фагоцитарного звена иммунитета.

Материалы и методы. Иммуностимулирующую терапию гликопином проводили у больных раком прямой и ободочной кишки, которым выполнялись различные по объему хирургические операции, на базе 24-й клинической больницы Москвы, Для профилактики гнойно-септических послеоперационных осложнений 3 группы больных (43, 33 и 36 человек) принимали по 1, 2 и 3 мг ГМДП внутрь в течение 10 дней до операции; других медикаментов больные не получали. Применение препарата заканчивалось накануне операции. Лечение гликопином проводились у 3 групп больных (41, 35 и 42 человека) с гнойно-септическими послеоперационными осложнениями по I, 2 и 3 мг препарата внутрь в течение 10 дней. В каждой группе часть больных получали гликопин, другая часть-плацебо.

При оценке эффективности гликопина для профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений прежде всего учитывали летальность и частоту развития этих осложненй. При оценке результатов применения гликопина для терапии гнойно-септических процессов учитывали летальность, частоту развития дополнительных, не связанных с первичным процессом, гнойно-септических осложнений и характер течения (прогрессирование) основного гнойно-септического процесса.

При проведении профилактики гнойно-септических осложнений проводили клинический анализ крови (содержание гемоглобина и формула крови), биохимическое (содержание сахара, билирубина, креатинина, мочевины, общего белка и альбумина) и иммунологическое исследование крови. перед началом приема гликопина и на 3-4 -е сутки послеоперационного периода. При терапии гнойно-септических осложнений эти исследования проводили перед началом и на 2-3-и сутки после окончания приема гликопина.

Иммунологическое исследование крови включало определение методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител (производство Института иммунологии Минздрава России) и прибора "Epics-Profile 2" ("Coulter") В-лимфоцитов (3F3), NK-клеток (CD 16) и субпопуляций Т-лимфоцитов (CDS, CD4, CD8); определение с помощью стандартной методики пролиферативной активности мононуклеаров при их стимуляции Т-митогеном-фитогемагглютинином (ФГА) и определение функциональной активности фагоцитирующих клеток по образованию ими активных форм кислорода в тесте лиминолзависимой хемилюминесценции [I].

Пролиферативную активность оценивали по интенсивности включения в нестимулированные (спонтанная пролиферация) и стимулированные (индуцированная пролиферация) ФГА клетки 3Н-тимидина (в импульсах в минуту), измеряемого на счетчике "β-Тгас" ("Becman"). Люминолзависимую хемилюминесценцию оценивали при сорбции клеток на пластик (спонтанная хемилюминесценция) и при их стимуляции опсонизированным зимозаном (индуцированная хемилюминесценция) по милливольтам на люминометре 1251 (LKB).

Для анализа эффективности гликопина вычисляли процент изменения каждого гематологического, биохимического и иммунологического параметра после лечения по сравнению с таковым до лечения. С помощью t-критерия Стьюдента сравнивали процент изменения соответствующего параметра в группе больных, получавших ГМДП, и в группе больных, получавших плацебо.

Результаты и обсуждение. Применение гликопина с целью профилактики снижало частоту гнойно-септических осложнений у больных раком толстой кишки (табл. 1). Так, процент осложнений у больных, получавших в день 1, 2 и 3 мг гликопина, составил 41,7, 29,4 и 35,3, процент осложнений у больных, получавших плацебо, составил 84,2, 50,0 и 63,1 соответственно. Наибольший эффект наблюдался в отношении частоты нагноения раны, нагноения в малом тазу и пневмоний. Методом несмешанной доверительной оценки с 5 % уровнем значимости [8] установлено, что разница суммарного процента осложнений в группах больных, получавших для профилактики гликопин (36,2), и суммарного процента осложнений в группах больных, получавших плацебо (66,6), статистически значима. Среди всех получавших для профилактики гликопин умерли 2 человека, а среди получавших плацебо - 8 человек.

Таблица 1. Летальность и гнойно-септические послеоперационные осложнения у больных, получавших ГМДП для профилактики

ГМДП, мг/сут

ГМДП  

Больные

Осложнения

Летальность

Больные

Осложнения

Летальность

Абс.

%

Абс.

%

1

24

10

41,7

1

19

16

84,2

2

2

17

5

29,4

0

16

8

50,0

2

3

17

6

35,3

1

19

12

63,1

4

Сумма

58

21

36,2

2

54

36

66,6

8

Применение гликопина для лечения гнойно-септических процессов, также дало положительный эффект: у больных, получавших этот препарат. реже возникали осложнения и прогрессирование основного процесса. В целом процент осложнений у больных, получавших в день 1, 2 и 3 мг гликопина, составил 60, 41,2 и 33,3, а процент осложнений у больных, получавших плацебо, составил 80,1, 55,6 и 66,7 соответственно (табл. 2). Однако разница суммарного процента осложнений в группах больных, получавших гликопин для лечения (44,8), и суммарного процента осложнений в группах больных, получавших плацебо (88,3), была статистически незначимой. Во всех группах, получавших гликопин для лечения, умерли 4 человека, а среди получавших плацебо - 11 человек. Как в этом случае, так и при применении гликопина для профилактики различие числа умерших с этим показателем у получавших плацебо было статистически незначимо.

Таблица 2. Летальность и гнойно-септические послеоперационные осложнения у больных, получавших ГМДП для лечения

ГМДП, мг/сут

ГМДП  

Больные

Осложнения

Летальность

Больные

Осложнения

Летальность

Абс.

%

Абс.

%

1

20

12

60,0

3

21

17

80,0

6

2

17

7

41,2

1

18

10

55,6

3

3

21

7

33,3

0

21

14

66,7

2

Сумма

58

21

44,8

4

60

41

68,3

11

Следует подчеркнуть, что ни в одном случае применения гликопина не наблюдалось каких-либо побочных эффектов. Переносимость препарата была отличная.

При клиническом анализе крови установлено, что все дозы гликопина, использованные как для профилактики, так и для лечения гнойно-септических процессов, вызывали у больных статистически значимое повышение числа лейкоцитов, причем в основном за счет нейтрофилов. Наибольшее увеличение лейкоцитов у больных давала доза гликопина 3 мг/сут (рис..1). На рис. 1-3 представлены данные по профилактическому применению гликопина в дозе 3 мг/сут.
Рис. 1. Изменение форменных элементов крови больных при применении ГМДП в дозе 3 мг/сут.

По оси абсцисс: изменение % лейкоцитов после приема ГМДП (1) или плацебо (2), изменение % лимфоцитов после приема ГМДП (3) или плацебо (4), изменение % нейтрофилов после приема ГМДП (5) или плацебо (6), изменение % моноцитов после приема ГМДП (7) или плацебо (8); здесь и на рис. 2 по оси ординат - процент клеток после приема ГМДП относительно их процентного содержания до приема. Здесь и на рис. 2 и 3 звездочкой отмечено p<0,05 по сравнений с данными при использовании плацебо.

При биохимическом анализе крови установлено, что, как правило, уровень гемоглобина, общего белка и альбумина у больных, получавших гликопин, был выше по сравнению с больными, получавшими плацебо. Уровень билирубина, мочевины и креатинина в крови больных, получавших гликопин, был ниже, чем у больных, получавших плацебо. Однако из-за большого разброса индивидуальных значений различие между этими показателями было значимо только в отношении гемоглобина при применении дозы гликопина 2 и 3 мг/сут и в отношении билирубнна и креатинина при профилактическом применении гликопина в дозе 2 мг/сут.
Рис. 2. Изменение субпопуляций лимфоцитов крови больных после приема ГМДП в дозе 3 мг/сут.

По оси абсцисс: изменение % СD5-клеток после приема ГМДП (1) или плацебо (2). изменение % CD4-клеток после приема ГМДП (3) или плацебо (4), изменение % CD8-клеток после приема ГМДП (5) или плацебо (6), изменение % СD16-клеток после приема ГМДП (7) или плацебо (8), изменение % В-клеток после приема ГМДП (9) или плацебо (10).

При иммунологическом анализе крови установлено, что наиболее выраженные изменения иммунологических параметров вызывало профилактическое применение гликопина в дозе 3 мг/сут. По сравнению с плацебо эта доза гликопина (см. рис. 2) вызывала достоверное увеличение общей популяции Т-лимфоцитов (CD5), Т-хелперов (CD4) и NK-клеток (CD16). Значимое увеличение Т-хелперов вызывали и другие дозы гликопина. Вероятно, способность гликопина влиять на СD4-лимфоциты является характерной чертой его иммуностимулирующего действия. Часто после приема гликопина происходило увеличение и числа В-лимфоцитов, но. значимое увеличение отмечено только при применении гликопина для лечения. В этом случае происходило и достоверное увеличение содержания IgM. Остальные классы иммуноглобулинов под влиянием гликопина оставались практически на том же уровне.

Значительный интерес представляют данные о функциональной активности лимфоцитов и фагоцитирующих клеток. Как правило, применение всех доз гликопина усиливало пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА, но в силу больших индивидуальных различий это увеличение статистически недостоверно. Аналогичная ситуация наблюдалась и в отношении хемилюминесценции: практически все дозы гликопина усиливали образование активных форм кислорода, но достоверное увеличение было только при профилактическом применении гликопина в дозе 2 и 3 мг/сут (см. рис. 3). Следует отметить, что указанные иммунологические параметры у больных, получавших плацебо, как правило, имели отрицательную динамику.
Рис. З. Изменение функциональной активности лимфоцитов и фагоцитирующих клеток в крови больных при применении ГМДП в дозе 3 мг/сут.

По оси абсцисс: изменение % спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов после приема ГМДП (1) или плацебо (2). Изменение % пролиферативной активности лимфоцитов; индуцированной ФГА после приема ГМДП (3) или плацебо (4), изменение % спонтанной хемилюминесценции после приема ГМДП (5) или плацебо (6), изменение % хемилюминесценции, индуцированной опсонизированным энмозаном. после приема ГМДП (7) или плацебо (8).
По оси ординат - уровень оценивавшихся показателей после, приема ГМДП в процентах от их уровня до приема ГМДП.

Суммируя представленные данные, можно сделать вывод, что гликопин клинически эффективен и снижает частоту гнойно-септических осложнений после операции при применении как для профилактики, так и с целью лечения. Однако статистически значимая разница в проценте осложнений была только при профилактическом применении препарата. Мы полагаем, что это связано прежде всего со способностью гликопина стимулировать иммунореактивность. В этом исследовании показана выраженная способность гликопина стимулировать функциональную активность фагоцитирующих клеток. Последние данные четко совпадают с результатами экспериментальных исследований [2, 5, 10].

Как правило, гнойно-септические инфекционные осложнения после операций вызываются условно-патогенными микроорганизмами: стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой и т. д., в борьбе с которыми главная роль принадлежит фагоцитозу. Так как гликопин стимулирует функциональную активность фагоцитов и увеличивает число Т-хелперов, которые синтезируют цитокины, вооружающие фагоциты, то, возможно, положительный клинический эффект препарата тесно связан с его иммуностимулирующей активностью. Также нельзя исключить, что лечебный эффект гликопина частично обусловлен его положительным влиянием на функцинальную активность печени, что проявляется в снижении уровня креатинина и билирубина в периферической крови больных, получавших этот препарат. Все это дает основание рекомендовать гликопин в комплексе методов, направленных на профилактику инфекционных послеоперационных осложнений.

Выводы.

1. При назначении внутрь больным раком кишечника в течение 10 дней перед операцией иммуностимулятора гликопина (ГМДП) - минимального компонента клеточной стенки бактерий получено статистически значимое снижение числа послеоперационных гнойно-септических осложнений по сравнению с больными, получавшими плацебо. При приеме внутрь больными раком кишечника этого - иммуностимулятора в течение 10 дней после операции снижались частота новых осложнений и прогрессирование основного процесса, но это различие по сравнению с больными, получавшими плацебо, было статистически незначимо.

2. У больных, получавших ГМДП, происходило значимое по сравнению с больными, получавшими плацебо, увеличение числа Т-хелперов (CD4) и функциональной активности фагоцитарных клеток периферической крови.

3. Полученные результаты позволяют рекомендовать ГМДП в комплексе методов, направленных на профилактику инфекционных послеоперационных осложнений.

ЛИТЕРАТУРА
1. Изучение функционального состояния фагоцитов человека: (Кислородный метаболизм и подвижность клеток): Метод, рекомендации / Земсков В. М., Барсуков А. М., Безносенко А. А. и др.- М., 1988.
2. Пименов А. А., Фукс Б. Б.. Андронова Т. М. // Международный симпозиум "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы": Тезисы докладов.- Пущино, 1987.- С. 39.
3. Пименов А. А., Рахмалевич А. Л., Деев В. В. и др. // Вопр. мед. химии.- 1990.- Т. 36.- С. 58-60.
4. Andronova Т., Ivanov V. // Sov. med. Rev. D. Immunol.- 1991.- N 4.- P. 1-63.
5. Balitsky К. P., Umansky V. Y., Tarakhovsky A. M. et al. // Int. J. Immunopharmacol.- 1989.-Vol. 11.- P. 429-434.
6. Bogdanov L. С., Dalev P. G., Gureuich A. I. et al. // FEBS Lett.- 1975.- Vol. 57.- P. 259-261.
7. Chedid L., Lederer В. // Biochem. Pharmacol.- 1978.- Vol. 27.- P. 2183-2186.
8. Hey J. 0. A- Introduction to Bayesian Statistical Inference for Economists. - New York, 1984.- P. 137,
9. Kusumoto S., Tarumi Y., Hienaka K. et al. // Bull. chem. Soc. Jap.- 1976.- Vol. 49.- P. 533-539.
10. Nesmjanov В. A., Khaiducov С. В.. Komaleua R. L. et al. // Biomed. Sci. - 1990.- Vol. 1.- P. 151-154.

Total Execution Time: 3.9000511169434 ms